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Tabela 1. Dados clínicos dos pacientes |
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Legenda: TCRBOA = Texas Cancer Research Biobank Open Access. Nota: A coluna celularidade tumoral na amostra indica o percentual do tecido da amostra que corresponde ao tumor. No paciente TCRBOA5, apenas 5% do tecido é tecido tumoral. |
Os tumores estavam localizados na cabeça do pâncreas, possuíam estágio T3, o que indicou que o tumor cresceu para além da glândula pancreática, N1, com acometimento de linfonodos, M0, e sem metástases, com exceção do paciente TCRBOA5 em quem não pôde ser determinada a presença ou ausência de metástase.
A qualidade do WES das amostras normal e tumoral é adequada, conforme análise do software FastQC27: todas com mais de 51 milhões de sequências de 101 bases, com conteúdo CG entre 45% e 46% e sem bases de baixa qualidade. Como consequência, o BWA26 realizou um bom alinhamento ao genoma de referência, GRCh38, conforme mostra a Tabela 2.
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Tabela 2. Qualidade do alinhamento por amostra |
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Fonte: Log de processamento do software BWA26. Legenda: TCRBOA = Texas Cancer Research Biobank Open Access. Nota: O software BWA alinha os reads de 100 pares de bases ao genoma de referência GRCh38. Para cada amostra, são informados a quantidade de reads de 100 pares de base produzidos pelos sequenciadores Illumina (coluna quantidade total de reads), quantos desses reads o BWA conseguiu alinhar ao genoma de referência (coluna quantidade de reads alinhados), quantos ele não conseguiu alinhar (coluna quantidade de reads não alinhados) e o percentual de reads alinhados. Os índices de alinhamento são superiores a 99% para todas as amostras, o que indica uma boa qualidade. A denominação da amostra é composta pela identificação do paciente seguida da terminação T ou N, conforme seja a amostra de tecido tumoral, ou normal, respectivamente. Desse modo, TCRBOA1-T identifica a amostra tumoral do paciente TCRBOA1. |
Após o alinhamento, na etapa de identificação de variantes, os softwares GATK e Mutec2 encontraram 123.174 variantes, sendo 87.170 germinativas e 36.004 somáticas. Os dados por paciente, amostra e tipo de tecido estão na Tabela 3.
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Tabela 3. Quantificação das variantes por amostra e tipo |
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Legendas: TCRBOA = Texas Cancer Research Biobank Open Access; SNP = base nitrogenada do genoma; INDEL = pequenas inserções ou deleções de algumas bases nitrogenadas no genoma. Nota: Cada paciente teve duas amostras tumorais sequenciadas: uma do tecido tumoral (PDAC) e outra de tecido saudável (glóbulos brancos). Uma vez alinhadas ao genoma de referência GRCh38, o software GATK identificou, para cada uma delas, as variantes presentes nas amostras. A tabela quantifica para cada amostra as variantes do tipo SNP, no qual apenas uma base está alterada no genoma da amostra, e do tipo INDEL, no qual diversas bases foram nele removidas ou inseridas. |
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Entre as variantes SNP e INDEL somáticas encontradas, 69 são de alta qualidade e estão mostradas na Figura 1, agrupadas por paciente. O gene KRAS está mutado em dois dos quatro pacientes. Mutações do tipo missense, nas quais há alteração na proteína capaz ou não de afetar sua função, e tipo nonsense, nas quais a alteração da proteína causa uma provável perda de função, são as mais prevalentes. Ademais, entre as variantes somáticas, três são de alto impacto (causam perda da função da proteína: genes AOPEP, DMD e DSCAM) e cinco patogênicas (genes KRAS, TP53, DMD e CYP27A1)35. A Figura 1 ilustra as variantes somáticas do tipo SNP e INDEL agrupadas por tumor, o que mostra de forma didática a diversidade e especificidade tumoral em nível molecular.
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Figura 1. Variantes somáticas encontradas nas amostras de PDAC dos pacientes Nota: A coluna à esquerda indica o nome do gene que apresenta mutações. Na linha, a identificação do paciente. A cor identifica o tipo de mutação: mutações do tipo missense, nas quais a mudança na base muda o códon do aminoácido, o que pode ou não prejudicar a função da proteína, e são as mais prevalentes. Nas mutações nonsense, a função da proteína é prejudicada pela mutação. A amostra TCRBOA5-T possui baixa celularidade tumoral, o que prejudica a análise. |
Das variantes estruturais (SV), identificou-se uma duplicação cromossômica na região 19q13.2, com aproximadamente 418 mil bases (Figura 2). Essa duplicação atingiu os genes MAP3K10, CNTD2, AKT2, C19orf47, PLD3, HIPK4, PRX, SERTAD1, BLVRB, SPTBN436.
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Figura 2. Alterações estruturais presentes no cromossomo 19 na amostra tumoral do paciente TCRBOA3 Nota: A região duplicada aparece como uma linha paralela horizontal. Essa região corresponde ao segmento 19q13.2 do cromossomo 19 e tem aproximadamente 418 mil bases. Entre os genes contidos nessa região está o AKT2, oncogene com evidência na literatura de associação com maior instabilidade cromossômica do tumor. |
Das variantes germinativas, tem-se 14 variantes patogênicas, sendo uma associada à pancreatite crônica (gene CFTR, variante rs113993960, deleção, paciente TCRBOA3); 93 variantes associadas a fatores de risco para doenças como: síndrome de Von-Hippel-Lindau (gene CCND1, variante rs9344, genótipo A/A, paciente TCRBOA2); e pancreatite hereditária (gene CTRC, variante rs121909239, genótipo C/T, paciente TCRBOA3)35. Por fim, as variantes associadas à melhor resposta a medicamentos: para os compostos de platina, o paciente TCRBOA5 apresenta as variantes rs1042522, gene TP53, genótipo C/C (polimorfismo do códon 72) e variante rs25487, gene XRCC1, genótipo C/C35.
A partir desses resultados, torna-se factível avaliar as possibilidades de terapia-alvo para os quatro pacientes, conforme as características moleculares das células contidas nas amostras tumorais e normais.
Discussão
Conforme a Tabela 1, os dados clínicos dos pacientes sugerem tumores semelhantes e, embora não haja informações sobre a aptidão dos pacientes para a quimioterapia, o protocolo estabelece abordagens análogas de terapêutica: cirurgia mais quimioterapia neoadjuvante e adjuvante com FOLFIRINOX6. Ocorre que, conforme os resultados obtidos a partir do WES, observa-se que, apesar de histologicamente similares, em nível molecular, os tumores dos quatro pacientes em análise são bem diversos, com importantes implicações na escolha do tratamento.
O PDAC do paciente TCRBOA3 apresenta duplicação do segmento 19q13.2, onde se localiza o gene AKT2. Esse oncogene pertence à via de sinalização do gene PI3K, associada ao crescimento, proliferação, sobrevivência e invasão celular, bem como resistência à quimioterapia e prognóstico reservado. Desse modo, é indicado avaliar o uso de terapias-alvo que inibam a via PI3K/AKT/mTOR37. Ainda, esse paciente possui mutação do gene KRAS (variante rs121913529, genótipo C/T) que também promove proliferação e sobrevivência celular. Logo, terapias-alvo de inibição da via RAS38 também estariam indicadas.
Em uma outra abordagem terapêutica, a presença da duplicação do segmento 19q13.2, somada ao elevado número de mutações somáticas, sugere tratar-se de um tumor com instabilidade estrutural, cuja resposta aos inibidores de PARP associados a quimioterápicos com platina é boa3,18. Ademais, esse paciente possui dois polimorfismos associados à pancreatite crônica (genes CFTR, variante rs113993960 e CTRC, variante rs121909239)35, o que indica o rastreio do PDAC nos seus ascendentes e descendentes.
Um quadro diverso se desenha para o paciente TCRBOA2. No seu tumor, a análise das variantes somáticas revela alterações nos genes associados à via das ciclinas/quinases dependentes de ciclinas (CDK): CCNA1, CDK14 e CDKN2C, que controlam a progressão do ciclo celular e cujas mutações resultam em proliferação celular desregulada e na formação de células-tronco, ambos mecanismos associados a um processo oncogênico. Assim, há a possibilidade do uso de terapias-alvo que inibam a via das CDK39 para impedir o crescimento tumoral. Esse fato, associado à pouca quantidade de mutações, e a ausência de alterações genômicas estruturais relevantes sugerem estabilidade genômica desse tumor, desaconselhando assim o uso de inibidores de PARP3,18. Não menos importante é a variante germinativa associada à síndrome de Von-Hippel-Lindau (gene CCND1 variante rs9344)35, o que também indica o rastreio do PDAC para os ascendentes e descendentes desse paciente.
Por sua vez, as variantes somáticas encontradas no tumor do TCRBOA5 não apresentaram nenhuma associação com aquelas documentadas como indutoras de PDAC. A razão disso pode ser a baixa celularidade tumoral presente na amostra sequenciada, de apenas 5%. Nessa análise, foram encontradas mutações do tipo nonsense nos genes NBEA e DSCAM, uma deleção no gene RBM47, genes KRAS e TP53 selvagens e ausência de alterações estruturais relevantes. Em relação às germinativas, esse paciente é portador de variantes associadas a uma melhor resposta a compostos de platina e melhor sobrevida (gene TP53, variante rs1042522, C/C e gene XRCC1, variante rs25487, C/C)35.
Por fim, o paciente TCRBOA1 apresentou mutações somáticas do tipo missense, entre elas a variante rs121913529, gene KRAS, genótipo T, cujo significado é patogênico e associado ao PDAC35. KRAS é um oncogene e pacientes com mutações apresentam mau prognóstico e baixa resposta à quimioterapia. De modo análogo ao paciente TCRBOA3, terapias-alvo inibidoras de KRAS são indicadas para o tratamento desse tumor. Uma outra característica é a ausência de instabilidade estrutural no genoma, o que contraindica os inibidores de PARP ou a imunoterapia3,18.
Um outro aspecto a ser analisado é que, a partir dos elementos vistos anteriormente, foi possível identificar características moleculares do tumor e do paciente que afetam o valor preditivo positivo do regime quimioterápico padrão. No paciente TCRBOA3, cujo AKT2 está duplicado, o uso do FOLFIRINOX sem inibir esse gene seria pouco eficaz; raciocínio análogo aplica-se ao paciente TCRBOA2, cuja via das CDK está permanentemente ativada.
Desse modo, para diminuir a morbimortalidade do PDAC, é necessário conhecê-lo em nível molecular, a fim de conformar a intervenção às características do tumor e do paciente. Para tanto, o WES mostra-se uma ferramenta adequada para alcançar esse objetivo.
Conclusão
O presente artigo apresentou todos os passos e as ferramentas necessários à execução da análise do exoma para identificar as variantes somáticas, germinativas e alterações estruturais no genoma do PDAC. A metodologia aqui descrita pode ser usada em quaisquer outras neoplasias e, embora realizada in silico, não só chegou aos mesmos oncogenes indutores de tumores anteriormente identificados nos pacientes TCRBOA1, TCRBOA2, TCRBOA3 e TCRBOA5, como também identificou uma inédita duplicação na região 19q13.2, onde se localiza o oncogene AKT2, no tumor do paciente TCRBOA3.
Também mostrou que, apesar de o estadiamento classificar uniformemente todos os PDAC, cada paciente – bem como o respectivo tumor – apresenta especificidades moleculares que afetam o diagnóstico e o desfecho clínico. A técnica de WES permite identificar essas especificidades e ampliar as possibilidades terapêuticas a partir do conhecimento das variantes somáticas, germinativas e alterações estruturais do genoma dos tumores. E que, considerando o preço do WES (aproximadamente 300 dólares), a relação custo-benefício é adequada, pois permite identificar as variantes somáticas e germinativas em um único exame. É necessário, contudo, reconhecer que essa técnica exige a formação de laboratórios específicos e com pessoal altamente treinado, incluindo bioinformática.
Por fim, pelas razões já expostas, fica clara a necessidade de divulgar e ampliar o uso da análise do WES nos serviços oncológicos, bem como capacitar as equipes na sua realização e utilização.
Ambos os autores contribuíram substancialmente na concepção e/ou no planejamento do estudo; na obtenção, análise e interpretação dos dados; na redação e revisão crítica; e aprovaram a versão final a ser publicada.
DECLARAÇÃO DE CONFLITO DE INTERESSES
Nada a declarar.
FONTES DE FINANCIAMENTO
Não há.
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Recebido em 24/7/2022
Aprovado em 5/10/2022
Editor-associado: Claudio Gustavo Stefanoff. Orcid iD: https://orcid.org/0000-0001-7050-3269
Editora-científica: Anke Bergmann. Orcid iD: https://orcid.org/0000-0002-1972-8777
Este é um artigo publicado em acesso aberto (Open Access) sob a licença Creative Commons Attribution, que permite uso, distribuição e reprodução em qualquer meio, sem restrições, desde que o trabalho original seja corretamente citado.
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